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新冠病毒检测为何出现假阴性?与试剂盒有关的

择要:试剂盒检测结果不仅与试剂盒质量有关,还与新冠病毒自身的特征、采样部位、采样量、运输和储存环节以及实验室检测前提和职员操作有关。

本文转载自中国新闻周刊

作者霍思伊 胥大年夜伟

2020年2月3日,武汉大年夜学中南病院影像科副主任张笑春发了一条同伙圈:“别迷信核酸检测了,强烈保举 CT 影像作为今朝 2019-nCoV 肺炎主要依据”,并称这是“一个一线影像医生的大年夜声疾呼!”

她的谈吐随后激发多方关注。

在尚无法准确猜测疫情拐点确当下,假如唯统统实着实诊手段无法包管,呈现错检和漏检,直接后果将是,很多核酸检测阴性但仍携带病毒的人得不到隔离,他们将成为新的熏染源。

一个范例的案例是,天津一女性感染病例,1 月 21 日呈现发烧后,前后共做了三次核酸检测均呈阴性,2月1日第四次检测后才呈阳性。

为何试剂盒检测会几回再三呈现假阴性?

就此问题,多位专家向《中国新闻周刊》解释,试剂盒检测结果不仅与试剂盒质量有关,还与新冠病毒自身的特征、采样部位、采样量、运输和储存环节,以及实验室检测前提和职员操作有关,由多种缘故原由构成,异常繁杂,但此中最关键的身分,与此次病毒的特殊性有关。

每个环节掉足都可能造成结果不准确

一位专门从事核酸检测的国家某重点实验室钻研员奉告《中国新闻周刊》,因为新冠病毒的特殊性,不合的采样部位对检出率有很大年夜影响。

他指出,最好的采样部位是肺部,由于这种病毒散播在肺部的浓度最大年夜,但要想采肺泡灌洗液,操作繁杂,必要仪器和各类引管,且对人的损伤很大年夜,是以只针对上了呼吸机的重症病人;其次是痰,但此次肺炎不像以往的甲流,很多病患干咳,无痰。是以,最普遍也最简单的采样要领是咽拭子,而咽部的新冠病毒量起码,以是会造成漏检。

另一位疾控系统内专门钻研核酸检测的专家对《中国新闻周刊》指出,有钻研注解,新冠病毒在人的上皮细胞复制异常慢,是以,在咽部,以致痰液内,病毒的基数都异常低,加大年夜了检测的难度。

“有的病人几回(检测)才呈阳性,这是正常的。由于可能病人前期渗出的病毒量很少,后期跟着病情的成长,病毒增多,才能检测出来,”前述钻研员说。

别的,是否采样准确、采到了关键部位,也会影响采样结果。以咽拭子为例,虽然是很简单的操作,只必要在咽部拿一个棉签整洁下,但每个医护职员划的轻重、若干都不相同。尤其在武汉,在日均检丈量超负荷的状态下,穿戴厚重防护服的医护职员要实现精准采样,难度很大年夜。

除了采样,从样本运输到实验室检测的诸多环节中,每一个环节掉足都可能造成查验结果的不准确。

因为病毒的RNA很轻易降解,敏感度很高,送样历程中必须采取冷链运输,保持在零下20度,一旦冻融跨越四次以上,样本就会受到损伤。此前,首批经由过程国家药监局审批的6家新冠病毒试剂盒临盆企业之一、上海之江生物科技株式会社曾对媒体表示,因为试剂盒要求零下 20 度的储存情况,仅少数有冷链能力的物流企业可以承运。在运输历程中稍不留意,有可能就会影响试剂盒终极的检测结果。

而且,使用试剂盒检测有很高的门槛,对实验室的前提也很苛刻。前述钻研员奉告《中国新闻周刊》,理论上PCR(即聚合酶链式反映)检测必须在生物安然防护达到三级的P3实验室做,但因为疫情缘故原由,为了短期内快速前进检测能力,国家将标准放宽,也容许P2实验室进行检测,但防护手段要达到P3,比如穿戴3级的防护服,检测职员被要求在生物安然柜里进行操作。

他指出,病毒基因扩增异常轻易交叉污染,以是实验室要分区,提取样品、发生反映和调配试剂要分手在三个互相自力的房间,房间之间形成压差梯度,前一环节房间的压力要大年夜于后一环节,以包管扩增的分子不倒流,否则试剂轻易被污染,造成假阳性,“这也是实验室今朝最头疼的一个问题”。

这对检测职员的操作规范提出了很高的要求。前述疾控系统专家指出,样本检测历程中会碰到很多问题,比如无意偶尔候扩增曲线没出来,短缺履历的检测职员很难判断,是试剂盒质量问题照样操作问题。“这不是一天两天能培训出来的,必要积累大年夜量的履历。”

自1月26日中国疾控中间把检测权限下放给各地市的三甲病院后,湖北省共有41家病院得到了查验资格。今朝,已经扩展到66家。但一样平常病院只有P2实验室,即便临时上马,将防护做到位,专业检测职员的短缺仍是个问题。

一份湖北省临床查验中间官网去年1月宣布的消息称,湖北第十六期PCR实验室技巧职员上岗培训班的参加人数为268人,在前年为220余人。

华中科技大年夜学同济医学院隶属同济病院查验科刘为勇在吸收媒体采访时坦言,查验师要有必然天资和从业履历,并不是每小我都能做的。“查验科的人手不敷,我们照样曩昔那些人,大年夜概十几个。除了检测以外,现在还要手动收拾、上报大年夜量患者信息。”

新冠病毒试剂盒临盆企业重庆中元汇吉生物技巧有限公司(简称中元生物)的一位技巧专家奉告《中国新闻周刊》,今朝的检测模式包括手工监测和全自动仪器检测两种。此中,手工检测要求检测职员必须具备相关的专业背景,操作还要纯熟化,“检测历程就像看病理切片,短期突击培训的职员很难胜任检测事情”。

据湖北省卫健委主任刘英姿先容,截至2月4日,全部湖北省能够供给PCR检测的实验室共有97家,包括省市的各级疾控中间18家、66家病院,以及13家第三方检测机构,日均检丈量能达到6000人份。

详细到武汉,截至今朝,武汉市共有31家机构同时开展核酸检测,核酸单日样本检测能力由最初的200份,提升到逐日4000余份。据武汉市新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控批示部先容,武汉核酸检测的最高能力,今朝最高可达到日6000~8000份。

按照批示部的支配,要在2月5日至7日两天内,完成武汉市所有疑似病例的核酸检测。

在2月6日的湖北省政府新闻宣布会上,武汉市卫生康健委主任张红星表示,今朝核酸检测试剂能满意需求,然则采样管、防护举措措施、采样职员还有必然缺口。

前述疾控专家指出,今朝,无论是试剂盒增产能,照样实验室结构,检测的前提已经基础改良了,下一步更关键的是,若何严格操作,前进实际的检测能力。

他说,“你把检测权赓续下放到病院,要看它有没有这个前提,具不具备这个能力。不能光把数字上满意了,但无法满意真正在一线的需求,产能是否满意和是否能把病人治好是两回事。”

CT影像,照样试剂盒检测?

2月5日,国家卫健委宣布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗规划(试行第五版)》。此中最主要的一个变更是,将湖北省和其他省份的诊断分类标准区分开来。

在湖北省,将蓝本的疑似病例标准拆分,蓝本的“老三条”:发烧、白细胞或淋巴细胞削减,以及肺部CT影像,被一分为二,只要满意前两条即可视为“疑似”,相称于放宽了疑似标准。但同时,将第三条肺部CT体现视为“临床诊断”,为湖北新增的一类诊断种别。确诊标准则没有改变,仍是试剂盒检测阳性和基因测序与新冠病毒同源。

这为CT和试剂盒的争辩暂时画上了句号。张笑春后来发文回应称,并非否定核酸检测结果,而是觉得其作为检测的终极手段,今朝仍受到产量、采样要领等限定,武汉无法在现阶段完全依附核酸检测去筛查病人,达到堵截熏染源的防控效果。

可以看出,她此前主张CT检测,主如果出于防控目的。在那条言辞猛烈的同伙圈中,她写道:应即刻启动只要与疑似病例有过打仗者均排查CT,只要CT阳性就近集中隔离于酒店宾馆或黉舍,不能放任无症状或核酸阴性CT阳性的人家庭留不雅。

但多位专家均对《中国新闻周刊》表示,新冠病毒CT的影像学体现与很多其他病毒性肺炎,如流感、呼吸道合胞病毒、腺病毒感染等对照类似,很难做鉴别性诊断。是以,今朝的技巧水平下,终极切实着实诊照样要靠试剂盒核酸检测。

是以,若何前进试剂盒准确率成为关键。对此,专家建议,除了采样、运输和检测在操作上要尽可能规范以外,还可以采取“双阳检测”,也便是用两家公司的试剂盒进行检测,或多次检测,以只管即便低落漏检率。

今朝,在一些有前提的病院,已经开始采取这种更审慎的检测法子。北京某三甲病院一位发烧门诊医生奉告《中国新闻周刊》,在他们病院,凡是疑似患者都要进行“双阳检测”后才能确诊。

一位武汉定点病院的医生也表示,为了前进准确度,病院会再次确认进行“双阳检测”。 据武汉市新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控批示部最新消息,截至2月5日,武汉各病院内的疑似病人,第二遍检测也已整个做完。

应急审批,流程从几年到几天

2月3日,工信部党组成员、总工程师田玉龙在国新办宣布会上表示,截至 2月1日,各家企业的日均试剂盒产能合计达到77.3 万人份,相称于疑似患者的40倍,而且这还只是“最大年夜产能的百分之六七十”。

多家试剂盒临盆企业奉告《中国新闻周刊》,试剂盒供需缺口的很快消弭,得益于国家药监局迅速推出的“绿色审批通道”。

1月22日,在武汉成立疫情防控批示部当天,17家企业在国家药监局的调集下,进行了一场现场应急答辩。此前,他们收到看护,因为新冠肺炎疫情严重,一线病院在短期内必要大年夜量试剂盒进行检测,国家药监局抉择开启快速审批通道,特事特办。

一位当时介入答辩的企业认真人奉告《中国新闻周刊》,虽然看护得很慌忙,但相关的材料仍要筹备齐备,和以往陈诉这类体外诊断试剂时提交的材料类似,主要包括综述资料、原材料、临盆工艺及产品阐明、继续3个临盆批次的注册查验等。现场有很多专家作为评委,在企业具体陈诉请示落后行表决。终极,有7家企业进入了应急审批通道。

1月26日,国家药监局宣布看护布告,称4家企业经由过程了应急审批,全部审批流程仅耗时4天。

此后,又分手于1月28日和1月31日先后共赞许6家新型冠状病毒试剂盒临盆企业的产品上市,分手是上海之江、圣湘生物、上海捷诺、上海伯杰医疗、中山大年夜学达安基因以及华大年夜基因。辉睿生物今朝仍处于审批中。

这个速率,被前述钻研员称为“空前未有的快”。他说,以埃博拉病毒为例,在当时那种紧急状态下,都是做完临床之后一个月才批的。

事实上,新冠病毒试剂盒这种与致病性病原体抗原、抗体以及核酸等检测相关的试剂,按国家律例,属于体外诊断试剂的第三类,也便是医疗东西中的最高检察级别,必要由国家食物药品监督治理总局检察,是以检察法度榜样也繁琐漫长。

正常环境下,审批至少要2~3年,不顺利的话无意偶尔会拖到5年,常常会要求补交各类材料,比如临床数据。曩昔,对试剂盒的稳定性钻研就要求至少一年,也便是放置在零下20度的情况内至少一年,实际要放置至少14个月。

国家药监局的官方告示指出,虽然此次是特事特办,但按照“统一批示、早期参与、随到随审、科学审批”的原则进行审批,不省流程,不低落标准。

一家首批获批的企业总经理奉告《中国新闻周刊》,国家药监局为每家企业指派两名审批咨询师长教师,双方共建一个微信群,在群内及时沟通审批事件,险些秒回。她还记得一个细节,有一天夜里三点,对方忽然在群里问,你这个资料筹备好了吗?“他们事情不分日夜,很费力,确凿是想要尽快把企业审批出来,”她说。

但前述钻研员指出,从几年缩短到几天,没有低落标准是弗成能的。据他走漏,首批审核的都容许减免临床试验,这在必然程度上低落了试剂盒的质量门槛。但这位钻研员也承认,在今朝这种应急状态下,假如照搬老规定,是不可的。

按曩昔的规定,一个试剂盒产品的陈诉必须上交三家具有临床天资的医疗机构共500人的病历数据,并有三家单位的具名盖章。此中,是否在对这500个病人应用试剂盒之前征得对方的批准,这涉及到伦理问题,必须把完备的规划递交所在医疗机构的伦理委员会审核,经审核批准后和病历数据一路提交。“光伦理这个环节,没半年下不来的,”他说。

为了增补这个破绽,在首批得到《医疗东西注册证》的备注一栏,国家药监局都注清楚明了:本产品仅为新冠病毒感染的肺炎的帮助诊断及应急贮备,有效期1年。延续注册时要补交临床数据。曩昔,这类证件的有效期一样平常是五年。

正介入第二品评审的深圳普瑞康生物技巧有限东莞公司董事长黄高健奉告《中国新闻周刊》,第二批陈诉中,要求比第一批要高,不能减免临床,而要求提交三家机构的数据。但仍比老例要求低,没有明确要求,这三家医疗机构必须是有临床天资的,相称于放宽了临床数据得到的范围,并且不要求伦理检察。

据他走漏,在第二批审核中,国家药监局把初筛权下放给各省,先由各省药监局组织初筛,经由过程后由省里向国家报。全部历程节奏也很快,接到省里看护后第二天就去答辩。今朝,他正等待国家的审批结果。

据他懂得,第二批陈诉的企业跨越100家,仅广东省就有近30家。

高产能背后

多位行业内人士向《中国新闻周刊》指出,因为PCR检测的技巧门槛不高,今朝,全国多家生物技巧公司纷繁加入到检测试剂盒的临盆浪潮中,这从第二批陈诉激增的企业数量就可以看出,对付这个此前较为小众的行业而言,新的入局者赓续涌入,此中不乏没有太多履历的小企业。

前述钻研员指出,今朝,各企业正在研发临盆的核酸检测试剂盒基础都采纳荧光 PCR 技巧。这个技巧早在1983年由美国科学家凯利·穆利斯提出,随后被利用于病毒检测、法医剖断和考古学等多个领域,后来颠末数个版本的优化,技巧本身已经异常成熟,也有一套完备的工艺体系。

PCR技巧的道理,是将新冠病毒的一段RNA片段逆转录成双链DNA,再经由过程DNA聚合酶进行扩增。原始的病毒遗传信息极其微量,不易被发明,扩增后更易被识别出来,然后经由过程一种荧光探针来捕捉,当扩增后的病毒浓度达到一个临界值时,就会孕育发生荧光旌旗灯号。这意味着,样本中被检测出携带新冠病毒。

在此前的埃博拉、甲性H1N1流感和中东呼吸综合征等病毒的检测中,都应用了这种技巧。也便是说,试剂盒检测的措施和技巧已经是一套固定的成熟体系,每次只要套用不合的病毒基因就行,技巧门槛不高。

是以,在1月10日,国家公布了新冠病毒全基因组序列之后,1月13日至14日,已有多家公司传播鼓吹研发出核酸检测试剂盒。中元生物在新型冠状病毒核酸检测试剂盒的研制只花了两天的光阴,该公司一位认真人对《中国新闻周刊》指出,因为中元生物在体外诊断试剂研发方面多有技巧积累,研发新型冠状病毒核酸检测试剂盒就好比“多加一个菜”。

多位受访的试剂盒临盆企业奉告《中国新闻周刊》,他们试剂盒的研制只用了两三天。

虽然门槛不高,但在前述疾控专家看来,在拔取RNA片段(靶序列)、引物和探针的设计、以及一整套工业流程的优化方面,要求企业有至少五年以上的积累和沉淀。否则,虽然基础的技巧措施便是PCR,但试剂盒质量仍旧良莠不齐。

他指出,衡量试剂盒的质量,主要有三个指标,特异性、灵敏度和重复性。特异性好,就意味着这个试剂盒只能检测新冠病毒,而不是其他病毒,比如流感或腺病毒。灵敏性高,就会削减漏检概率,检出率高。重复性强,则代表稳定性好。是以,三个指标中,最紧张的是灵敏度,这也是各类不合试剂盒质量差异的核心所在。

他说,现有这些公司的技巧,只如果经由过程国家药监局审批,也即在技巧标准层面经由过程其下属的中国食物药品检定钻研院(简称中检院)检定的,特异性一样平常都能包管在99%以上,但灵敏度各家不合。“中检院的剖断保准是一个最低门槛,过了这个门槛上面还有好几个台阶,有的更高一点,有的更低一点。不合的灵敏度,对检测的准确性影响很大年夜,有的很灵敏,浓度很低的病毒也可以检测出来,就不会漏检,有的不太灵敏,就会呈现假阴性。”

跟着疫情的成长,对付检测试剂质量标准的要求不仅仅是快,更要求包管高灵敏度。然而,现实是,相关检测试剂的研发临盆短缺统一且明确的行业标准。

据中元生物前述技巧专家先容,在诊断试剂行业,行业标准虽然早已存在,但标准对付不合产品中品类的限定并没有细化。新冠病毒是新近发明的,让国家去主导做一个新冠肺炎试剂的标准,短期内是不现实的。在他看来,今朝行业内免不了一些企业借着试剂盒的噱头进行炒作。在这次的疫情防护历程傍边,相关检测试剂厂家的产品之间,质量存在参差不齐的征象。

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